• Nicole

Fibromialgia causata da autoanticorpi...con NPF annessa

Studio : Trasferimento passivo dei sintomi della fibromialgia da pazienti ai topi

https://www.jci.org/articles/view/144201

La sindrome fibromialgica (FMS) è caratterizzata da dolore e dolorabilità diffusi e i pazienti in genere sperimentano affaticamento e disagio emotivo. L'eziologia e la fisiopatologia della fibromialgia non sono completamente spiegate e non esistono trattamenti farmacologici efficaci. Qui mostriamo che le IgG dei pazienti FMS hanno prodotto ipersensibilità sensoriale sensibilizzando i neuroni nocicettivi. I topi trattati con IgG di pazienti FMS hanno mostrato una maggiore sensibilità alla stimolazione nociva meccanica e fredda e le fibre nocicettive nelle preparazioni dei nervi cutanei di topi trattati con IgG FMS hanno mostrato una maggiore reattività alla stimolazione fredda e meccanica. Questi topi hanno anche mostrato una ridotta attività locomotoria, ridotta forza di presa della zampa e una perdita di innervazione intraepidermica. Al contrario, il trasferimento di siero impoverito di IgG da pazienti FMS o di IgG da controlli sani

i soggetti non hanno avuto effetto. Il paziente IgG non ha attivato direttamente i neuroni sensoriali ingenui. Le IgG dei pazienti FMS hanno marcato cellule gliali e neuroni satellite in vivo e in vitro, nonché tratti di fibre mielinizzate e un piccolo numero di macrofagi e cellule endoteliali nei gangli della radice dorsale del topo (DRG), ma nessuna cellula nel midollo spinale. Inoltre, FMS IgG si lega al DRG umano. I nostri risultati dimostrano che le IgG dei pazienti FMS producono ipersensibilità sensoriali dolorose sensibilizzando le afferenze nocicettive periferiche e suggeriscono che le terapie che riducono i titoli di IgG dei pazienti possono essere efficaci per la fibromialgia

introduzione

La sindrome fibromialgica (FMS) è una condizione di dolore cronico caratterizzata da dolore diffuso, aumentata sensibilità al dolore pressione meccanica e basse temperature (1-4), così come stanchezza e stress emotivo (5-7). La prevalenza della FMS è almeno del 2% (8) e circa l'80% dei pazienti FMS sono donne. La prevalenza sale al 10%-30% tra i pazienti con diagnosi di condizioni reumatologiche autoimmuni (9, 10) e la FMS è quindi una delle condizioni di dolore cronico più comuni. L'eziologia e la fisiopatologia della FMS non sono completamente comprese (11) e le attuali strategie di trattamento per la FMS si basano principalmente sui cambiamenti dello stile di vita, sull'esercizio fisico e sulla terapia farmacologica con antidepressivi e anticonvulsivanti. Sfortunatamente, la modesta efficacia delle terapie disponibili nella maggior parte dei pazienti lascia un enorme bisogno clinico insoddisfatto (12, 13). I modelli animali che sono stati utilizzati per studi sperimentali di FMS hanno incerta rilevanza traslazionale e si basano su iniezioni intramuscolari locali ripetute di acido (14) o sulla deplezione sistemica di monoamine mediante trattamento con reserpina (15). Lo sviluppo di nuove terapie basate su meccanismi è stato ostacolato dalla comprensione limitata delle basi della FMS. L'aumentata sensibilità polimodale al dolore sperimentata dai pazienti FMS (1, 16) è associata ad alterata elaborazione del dolore nel sistema nervoso centrale (11), modulazione disfunzionale del dolore discendente (17, 18) e cambiamenti strutturali e funzionali nel cervello ( 19-21). La FMS è anche associata ad anomalie nelle afferenze sensoriali periferiche, come l'attività spontanea e la sensibilizzazione delle fibre C e la perdita dell'innervazione epidermica (22, 23). Sono stati riportati anche livelli alterati di citochine infiammatorie e immunoregolatrici nei pazienti FMS. Sebbene queste alterazioni non seguano uno schema coerente (24, 25), possono suggerire che i processi immunitari siano disregolati nei pazienti. Queste osservazioni, insieme alla prevalenza marcatamente aumentata della FMS tra i pazienti con condizioni reumatologiche autoimmuni (9, 10) e alle dimostrazioni che dolori cronici meno comuni (26, 27) e molto rari (28) sono causati da autoanticorpi, ci hanno portato ipotizzare che la FMS possa avere una base autoimmune. Qui abbiamo studiato la possibilità che le IgG autoreattive siano responsabili di diversi sintomi chiave della FMS, esaminando se queste possono essere trasferite ai topi mediante somministrazione di IgG purificate da pazienti FMS e valutando la localizzazione tissutale delle IgG dopo il trasferimento passivo.

Risultati

Trasferimento passivo di ipersensibilità sensoriali. Le IgG purificate dal siero di singoli pazienti FMS e di soggetti sani di controllo (HC) reclutati dal Walton Centre (Liv erpool, Regno Unito [UK]) sono state somministrate a topi femmina mediante iniezione intraperitoneale per 4 giorni consecutivi (8 mg al giorno). Questo regime posologico si basava sugli studi originali che identificavano la miastenia grave come un disturbo mediato da autoanticorpi (29, 30) e su studi più recenti sulla sindrome dolorosa regionale complessa (26, 31). Poiché la FMS è caratterizzata da ipersensibilità alla pressione meccanica, abbiamo esaminato le soglie di ritiro della zampa nei topi utilizzando il test della pressione della zampa di Randall-Selitto dopo il trasferimento di IgG. Le IgG di ciascuno degli 8 singoli pazienti, ma non di nessuno dei 6 soggetti HC, hanno prodotto rapidamente ipersensibilità meccanica (Figura 1, A–F). Oltre alla sensibilità alla pressione, i pazienti riferiscono frequentemente che il dolore è esacerbato dalle temperature fredde e dai test sensoriali quantitativi ha dimostrato una maggiore sensibilità al dolore freddo nella FMS (1, 2, 4, 16). In buon accordo con le osservazioni dei pazienti, la somministrazione di IgG da 7 degli 8 pazienti FMS ha dato luogo a una sensibilità significativamente maggiore al freddo nocivo nei topi (Figura 1, G–L). Tutti e due

le ipersensibilità meccaniche e al freddo sono state tipicamente stabilite entro 24-48 ore dopo la prima iniezione e sono state mantenute per più di 1 settimana. L'ipersensibilità osservata prodotta dai preparati di IgG da diversi pazienti FMS ha mostrato ampiezze e tempi simili (Figura 1, A–L e Figura 1, A e B supplementare; materiale supplementare disponibile online

con questo articolo; https://doi.org/10.1172/JCI144201DS11), che si riflette nelle sensibilità medie meccaniche e al freddo prodotte dalle IgG di questi 8 singoli pazienti FMS e 6 soggetti HC misurati in 10 giorni (Figura supplementare 1, C e D). FMS IgG ha anche generato ipersensibilità alla stimolazione con filamenti di von Frey calibrati, un test ampiamente utilizzato di nocicezione meccanica nei topi (Figura 2A). Il dolore fibromialgico è caratteristicamente diffuso e gli studi sulla localizzazione corporea del dolore hanno identificato la coscia come una delle sedi più comunemente colpite (32, 33). Abbiamo quindi esaminato la sensibilità alla pressione della coscia utilizzando il dispositivo Randall-Selitto (Figura 2B), per determinare se FMS IgG influisce sulla sensibilità alla pressione di siti diversi dalla zampa posteriore nei topi. In questo test, FMS IgG ha prodotto una significativa ipersensibilità meccanica nella coscia rispetto al trattamento con IgG da HC (Figura 2B). La FMS è più comune tra le donne rispetto agli uomini, e quindi ci siamo chiesti se una maggiore sensibilità agli effetti delle IgG contribuisca all'aumento dell'incidenza nelle donne. Abbiamo esaminato questa possibilità confrontando gli effetti delle IgG di una paziente in topi femmine e maschi. Abbiamo osservato ipersensibilità meccaniche e al freddo significative e indistinguibili nei topi femmine e maschi (Figura 2, C e D), suggerendo che è improbabile che i risultati comportamentali descritti siano dovuti all'aumentata sensibilità femminile alle IgG FMS. Finora avevamo somministrato in tutto 4 iniezioni di 8 mg di IgG.

Per identificare una relazione dose-risposta per IgG daun paziente, abbiamo variato il numero di iniezioni giornaliere tra 1 e 4 (Figura 2E). In questo esperimento, 1, 2 e 4 iniezioni di 8 mg hanno prodotto modelli essenzialmente identici di ipersensibilità meccanica. Abbiamo inoltre esaminato gli effetti delle singole iniezioni di 2, 4 e 8 mg di FMS IgG e hanno scoperto che solo la dose più elevata aumentava la sensibilità meccanica nel test della pressione della zampa (Figura 2F). Questi dati suggeriscono che una singola iniezione di 8 mg di IgG può essere sufficiente per trasferire l'ipersensibilità meccanica ai topi, e che l'effetto è saturabile (Figura 2E). Poiché la FMS è regolarmente associata a una ridotta forza muscolare e la gravità della FMS è correlata negativamente con la forza della presa (34, 35), abbiamo cercato di valutarla sperimentalmente monitorando la forza della presa della zampa anteriore nei topi. In questo test, FMS IgG ha ridotto significativamente la forza di presa rispetto ai topi trattati con HC IgG (Figura 2G). Per determinare se gli anticorpi sono responsabili di ipersensibilità dolorose in una coorte più ampia e distinta a livello regionale di pazienti FMS (reclutati presso il Karolinska Institute; Supplemental Table

1), abbiamo esaminato gli effetti delle preparazioni di IgG raccolte da più pazienti FMS e soggetti HC. Come previsto, i pazienti FMS hanno mostrato valutazioni del dolore notevolmente più elevate su una scala analogica visiva (VAS) (Figura 3A e Tabella supplementare 2) e una sensibilità al dolore da pressione significativamente maggiore rispetto ai soggetti HC (Figura 3B e Tabella supplementare 2). I livelli sierici di isotipi di IgG dei soggetti FMS e HC rientravano negli intervalli di concentrazione normali pubblicati (36) nonostante l'IgG1 fosse inferiore nel siero FMS rispetto al siero HC (per i soggetti svedesi; tabella supplementare 3). La somministrazione di IgG in pool da 2 gruppi separati di pazienti FMS a topi (8-14 individui per gruppo, 2 esperimenti; Tabella supplementare 2) ha aumentato significativamente la sensibilità nel test della pressione della zampa rispetto alla somministrazione di IgG in pool da gruppi di soggetti con HC (Figura 3C). In questi esperimenti abbiamo utilizzato un regime di dosaggio di 8 mg IgG per 4 giorni consecutivi. Simile al nostro osservazioni con IgG da singoli pazienti (Figura 1), le IgG FMS aggregate hanno anche suscitato ipersensibilità al freddo (Figura 3D). Per determinare la durata dell'ipersensibilità IgG-mediata in modo più dettagliato, abbiamo studiato le soglie meccaniche e le latenze al freddo nei topi trattati con IgG raggruppati da pazienti o soggetti HC per 1 mese. Seguì l'insorgenza di ipersensibilità prodotte da FMS IgG in pool lo stesso decorso temporale visto con IgG da donatori individuali e

risolto completamente circa 2,5 settimane dopo la cessazione della somministrazione di IgG (Figura 3, E e F; vedere la Figura 1 supplementare per il decorso temporale con IgG da un singolo paziente), che è coerente con il decorso temporale per l'eliminazione delle IgG umane dai topi (37). Successivamente abbiamo confrontato gli effetti delle IgG del paziente FMS con il siero del paziente depleto di IgG dello stesso individuo per valutare se le immunoglobuline e i componenti del siero diversi dalle IgG possono contribuire al dolore e all'ipersensibilità (Figura 4). Come previsto, le IgG di un paziente FMS (8 mg per 4 giorni consecutivi) hanno prodotto marcate ipersensibilità al freddo e meccaniche, ma il siero impoverito di IgG dello stesso paziente e le preparazioni raccolte da gruppi di pazienti FMS o soggetti HC erano senza alcun comportamento distinguibile effetto (Figura 4, A e B).

Le IgG dei pazienti riducono l'attività locomotoria nei topi. Fatica, a sensazione di eccessiva stanchezza e debolezza mentale o fisica,

è uno dei sintomi chiave della FMS (38), ma anche di un'ampia gamma di altre malattie croniche (39). I pazienti FMS spesso mostrano una riduzione livelli di attività fisica (40), con una perdita di forma fisica come conseguenza (41). Incoraggiati dalla dimostrazione di una ridotta forza di presa in seguito alla somministrazione di FMS IgG, abbiamo successivamente esaminato l'attività locomotoria di topi iniettati con FMS IgG o HC IgG per un periodo di 24 ore. In questo esperimento abbiamo utilizzato IgG in pool da nuovi gruppi di pazienti FMS e soggetti HC (Pool 3, Sup plemental Table 2). Simile alle precedenti 2 coorti (vedi Figura 3, A e B), i pazienti hanno mostrato valutazioni del dolore VAS più elevate e una maggiore sensibilità al dolore da pressione rispetto ai soggetti HC (Figura 5, A e B e Tabella supplementare 2). Poiché gli studi dose-risposta hanno mostrato che 2 iniezioni di FMS IgG erano sufficienti per indurre una marcata ipersensibilità meccanica (vedi Figura 2), 8 mg di IgG in pool sono stati iniettati per via intraperitoneale per 2 giorni consecutivi. Come previsto, i topi erano notevolmente meno attivi durante il giorno rispetto alla fase buia (18:00-6:00 ore), indipendentemente dal fatto che ricevessero HC o FMS IgG (Figura 5C). Durante la notte (18:00-6:00, quando i topi sono più attivi), il numero totale di movimenti registrati nei topi trattati con FMS IgG è stato ridotto. Esaminando più in dettaglio, è apparso evidente che questa riduzione era prevalentemente nella fase più attiva (22:00–02:00; Figura 5, D–F). Questi risultati dimostrano che la FMS IgG ha un impatto negativo sui comportamenti evocati e non evocati nei topi.

Sensibilizzazione dei nocicettori.

La microneurografia dei pazienti FMS ha dimostrato la sensibilizzazione delle fibre C nocicettive (22). Per determinare se le anomalie sensoriali dimostrate nei topi in vivo dopo la somministrazione di IgG del paziente FMS potessero essere spiegate da una sensibilizzazione dei nocicettori periferici, abbiamo esaminato singole unità di fibre afferenti nelle preparazioni del nervo safeno cutaneo di topi trattati con IgG. Le singole unità sono state classificate in base alla loro velocità di conduzione e soglia di risposta meccanica, come descritto in precedenza (42, 43). Abbiamo stimolato meccanicamente i campi recettivi dei nocicettori meccanosensibili Aδ e C (fibre AM e CM) e confrontato le soglie di attivazione meccanica (la forza richiesta per suscitare almeno 2 potenziali d'azione durante 2 secondi challenge) dopo 4 giorni di trattamento con HC o FMS IgG (Figura 6, A–C). Sia le fibre AM che CM nelle preparazioni di topi trattati con FMS IgG hanno risposto alla stimolazione meccanica con una forza ridotta rispetto alle preparazioni di topi trattati con HC IgG (Figura 6, A–C). Le soglie di risposta meccanica ridotte sono coerenti con la sensibilizzazione della fibra C osservata inI pazienti FMS utilizzano la microneurografia (22) e dimostrano che le IgG del paziente producono un'elevata reattività dei nocicettori periferici che viene mantenuta in assenza del sistema nervoso centrale. Dato che avevamo osservato un robusto raffreddore comportamentale

ipersensibilità nei topi trattati con FMS IgG, abbiamo anche esaminato se questo fenotipo fosse accompagnato da una maggiore reattività al freddo nelle fibre C meccanosensibili (Figura 6, D–F). Abbiamo messo alla prova le fibre CM con una rampa di raffreddamento di 60 secondi (da 32°C a 5°C-9°C) e abbiamo notato che una proporzione maggiore di fibre CM ha risposto al freddo nelle preparazioni di topi trattati con FMS IgG rispetto a HC IgG ( Figura 6D). Al contrario, FMS IgG non ha influenzato le soglie di attivazione del freddo del CM sensibile al freddo (Figura 6E). Un numero crescente di disturbi umani è riconosciuto come prodotto da autoanticorpi funzionali che alterano l'eccitabilità legandosi a proteine ​​di superficie neuronale (44). Abbiamo quindi sfidato i neuroni isolati direttamente con un'alta concentrazione di FMS IgG (200 μg/mL), per determinare se FMS IgG eccita direttamente i gangli della radice dorsale (DRG) neuroni da tale interazione. Non abbiamo osservato alcun effetto delle IgG FMS sulla concentrazione intracellulare di Ca2+ ([Ca2+]i) in nessuno degli 870 neuroni esaminati (Figura 6G). Localizzazione immunoistochimica in vivo delle IgG umane. Poiché le fibre CM e AM erano ipersensibili nei topi trattati con FMS IgG, abbiamo studiato la localizzazione di FMS IgG per comprendere meglio i potenziali siti di azione. Nei topi iniettati con IgG raggruppate, le IgG FMS sono state costantemente rilevate nei DRG, ma né nel cervello né nel tessuto del midollo spinale mediante analisi Western blot (Figura 7A; vedere

macchie complete inedite nel materiale supplementare). L'analisi immunoistochimica dei tessuti di topi a cui era stato iniettato un pool di IgG FMS, utilizzando anticorpi IgG anti-umani per rilevare IgG FMS, ha rivelato una colorazione robusta nel DRG lombare (Figura 7, B e C), mentre non è stata osservata alcuna immunoreattività specifica nel midollo spinale (Figura 7A e Figura 2A supplementare). L'area di età percentuale che è risultata immunoreattiva per le IgG umane così come il l'intensità dei pixel era molto maggiore nei topi a cui erano stati iniettati IgG FMS rispetto alle IgG dei soggetti HC e le IgG anti-umane generavano solo una reattività minima in DRG da topi iniettati con soluzione salina (Figura 7, B e C).

La colorazione IgG del paziente FMS è stata principalmente localizzata nelle cellule gliali satellite (SGC, visualizzate dalla colorazione con glutammina sintasi) e nei tratti di fibre che entrano nel DRG, nonché in un piccolo numero di macrofagi Iba1-positivi e vasi sanguigni CD31-positivi (Figura 7D). FMS IgG non sembrava colocalizzare con il marcatore del nucleo neuronale NeuN, che marca i nuclei neuronali e, in misura minore, il citoplasma. Poiché NeuN non etichetta le membrane neuronali e gli SGC avvolgono i neuroni con una separazione di appena 20 nm tra le cellule, è stato difficile distinguere la colorazione della membrana neuronale da quella dell'SGC circostante (Figura 7D). Abbiamo ulteriormente esplorato la possibilità che FMS IgG marchi anche le membrane dei neuroni sensoriali utilizzando TrkA come marker di superficie neuronale. Oltre all'ampia etichettatura FMS IgG di SGC che esprimono glutammina sintasi (Figura 7, D ed E), FMS IgG sembrava etichettare anche alcuni, ma non tutti, i neuroni che esprimono TrkA (Figura 7E). FMS IgG promuove l'espressione di SGC marcatori di attività. Poiché le IgG FMS frequentemente colocalizzate con SGC, abbiamo studiato se questo fosse associato a prove di cambiamenti nell'attività SGC. Abbiamo scoperto che l'area positiva e l'intensità dei pixel dell'immunoreattività della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) (Figura 8, A e B) e dell'espressione genica di Gfap e s100b (Figura 8C) in DRG da topi iniettati con FMS IgG erano aumentati, rispetto a HC Controlli iniettati con IgG. Questi cambiamenti suggeriscono che la presenza di FMS IgG nei DRG ha aumentato l'attività degli SGC. Al contrario, l'area percentuale di immunoreattività Iba1 nell'area ricca di neuroni del DRG non era diversa tra i topi FMS IgG e HC IgG (Figura 8, D ed E), suggerendo che l'accumulo di IgG FMS nel DRG non stimolare la proliferazione o l'infiltrazione locale dei macrofagi. Tuttavia, Aif1 (codifica Iba1) e Itagm (codifica CD11b) erano entrambi elevati nel DRG dei topi iniettati con IgG FMS (Figura 8F), indicando che alcuni aspetti dell'attività dei macrofagi erano alterati da IgG FMS. È importante sottolineare che c'erano poche o nessuna cellula apoptotica nel DRG di topi iniettati con FMS o HC IgG (Figura 3A supplementare), indicando che gli effetti di FMS IgG non sono dovuti alla morte delle cellule neuronali. In contrasto

al DRG, non sono stati osservati cambiamenti nella reattività degli astrociti e della microglia nel midollo spinale in base al GFAP (Figura supplementare 2, B–D) e Iba1 (Figura supplementare 2, E–G) immunoreattività,rispettivamente. Insieme, questi risultati suggeriscono che FMS IgG ha un effetto locale nel DRG.

FMS IgG non induce la produzione di citochine o l'infiammazione sistemica. Sebbene vi siano incongruenze tra gli studi pubblicati, è stato riportato che i livelli di citochine e chemochine infiammatorie e immunomodulanti, come IL-6, IL-8 e IL-10, sono elevati nel siero o nel plasma della FMS (22, 23) rispetto agli HC. Pertanto, abbiamo valutato un pannello di fattori nel siero di topi iniettati con FMS IgG, HC IgG o soluzione salina. IL-1β era al di sotto del limite di rilevamento in 5 dei 6 campioni in ciascun gruppo, indicando che né FMS IgG né HC IgG hanno indotto la produzione di IL-1β. Allo stesso modo, non c'era alcuna differenza nei livelli di TNF-α, CXCL1 (un analogo murino di IL-8 umano), IL-2, IL-5, IL-6, IL-10 e IFN-γ tra i gruppi (Figura 8 , G-M). Questi dati dimostrano che l'iniezione di IgG FMS non altera il livelli di citochine infiammatorie e immunomodulanti sistemiche.

Insieme, i risultati suggeriscono che FMS IgG agisce generando un effetto locale nel DRG.Legame immunoistochimico in vitro di FMS IgG. Per differenziare ulteriormente tra l'etichettatura di SGC e neuroni sensoriali, abbiamo esaminato l'immunoreattività di FMS e HC IgG in colture cellulari arricchite di SGC, impoverite di neuroni sensoriali e colture cellulari ricche di neuroni DRG dissociate. FMS IgG o HC IgG (IgG in pool, 100 μg/mL) sono stati aggiunti al terreno di coltura prima della fissazione delle cellule per esaminare l'etichettatura della membrana in una condizione non permeabilizzante. Nelle colture arricchite con SGC, circa il 75% delle cellule erano SGC positive alla glutammina sintasi e meno dello 0,5% erano neuroni. FMS IgG si è legata a una proporzione significativamente maggiore di cellule (290 su 368 cellule analizzate, 79%) rispetto a HC IgG (84 su 264 cellule analizzate, 32%) (Figura 9, A–C), e ha riconosciuto queste cellule più fortemente, come giudicato dall'intensità dei pixel (Figura 9D). Allo stesso modo, FMS IgG ha marcato una proporzione significativamente maggiore di entrambe le cellule glutammina sintasi-positive (SGC) e negative (non SGC) in queste colture e lo ha fatto con una maggiore intensità di pixel rispetto a HC IgG (Figura 9, E e F). Nelle colture di neuroni DRG dissociati circa il 30% delle cellule erano neuroni III-tubulina-positivi (Figura 9G). Analogamente alle nostre osservazioni con colture arricchite di SGC, FMS IgG si è legata a una proporzione maggiore di cellule da DRG dissociato (358 su 527 cellule analizzate, 68%) rispetto a HC IgG (158 su 469 cellule analizzate, 34%) , e ha anche etichettato queste cellule in modo più intenso (Figura 9, H–J). È importante sottolineare che l'FMS IgG ha etichettato quasi tutti i neuroni III-tubulina-positivi, mentre l'HC IgG ne ha etichettati molto meno (Figura 9K). L'intensità dei pixel del legame di FMS IgG ai neuroni era maggiore del legame di FMS IgG a cellule non neuronali e maggiore del legame di HC IgG a neuroni e cellule non neuronali (Figura 9L). Né FMS IgG né HC IgG hanno influito sulla vitalità cellulare rispetto alle cellule che non sono state incubate con anticorpi (Figura supplementare 3, B–E).

Infine, l'incubazione di colture vive con IB4, un marcatore di membrana di una sottopopolazione di nocicettori, ha dimostrato che il legame IgG dell'FMS è colocalizzato con membrane neuronali (Figura 9M). In conclusione, l'FMS IgG si lega agli SGC in vivo e, sebbene siano necessari ulteriori studi per determinare se l'FMS IgG si lega anche alle membrane neuronali in vivo, questa possibilità è supportata dai nostri dati che mostrano che l'FMS IgG si lega sia agli SGC che ai neuroni in vitro. innervazione. Un coinvolgimento dei nervi sensoriali periferici nella FMS è stato precedentemente indicato dalle osservazioni della patologia delle piccole fibre nei pazienti (23, 45). È importante sottolineare che la gravità dei sintomi della FMS è correlata con l'estensione della patologia delle piccole fibre (33). Abbiamo quindi esaminato l'impatto delle IgG sulla densità delle fibre nervose intraepidermiche (IENFD) nella pelle della zampa posteriore glabra dei topi. Una riduzione significativa di IENFD era evidente 14 giorni dopo l'inizio della somministrazione di FMS IgG, rispetto a sezioni di pelle di topi trattati in modo simile con HC IgG (Figura 10, A e B). Screening della reattività di FMS IgG con frammenti di proteine umane. Per indagare se le IgG FMS di diversi pazienti contengono un modello comune di autoreattività, abbiamo utilizzato uno schermo di microarray a livello di proteoma (SciLifeLab). Questo test utilizza 42.000 peptidi umani (da >18.000 proteine) dall'Atlante delle proteine umane (46, 47). I peptidi nell'array sono lineari, prodotti in E. coli e la maggior parte ha una lunghezza compresa tra 50 e 150 amminoacidi. Abbiamo esaminato la reattività di 4 campioni, ciascuno preparato da parti uguali di 4 sieri di pazienti FMS (4×4), e abbiamo notato che tutti e 4 i campioni hanno riconosciuto più peptidi (segnale > intensità di fluorescenza media + [4 × SD]; Supplemento Tabella 5). Tuttavia, la nostra analisi ha anche rivelato che pochissimi peptidi sono stati riconosciuti da più di uno dei campioni raggruppati, indicando fortemente che è improbabile che gli antigeni inclusi nell'array rappresentino un comune autoantigene nei pazienti FMS. L'analisi della sovrarappresentazione (http://webgestalt.org/; ref. 48) ha suggerito un certo grado di arricchimento per le proteine associate ai termini di Gene Ontology (GO) relativi a componenti cellulari e microtubuli (Tabella supplementare 6 e Figura supplementare 4), e un piccolo numero di percorsi KEGG correlato al metabolismo e al ciclo delle vescicole (Tabella supplementare 7 e Figura supplementare 5).

FMS IgG si lega al DRG umano. Infine, abbiamo valutato se FMS IgG lega le cellule nel DRG umano. Le sezioni DRG umane sono state incubate con HC IgG o FMS IgG raggruppate e sono state analizzate l'intensità e la localizzazione del legame. Cellule FMS legate a IgG nei DRG umani in misura maggiore rispetto a HC IgG, come valutato da intensità dei pixel (Figura 11, A e B). Inoltre, le cellule immunoreattive GFAP-im legate FMS IgG e le cellule immunoreattive NF200-, indicando che le IgG FMS si legano sia agli SGC umani che a quelli umani

neuroni sensoriali (Figura 11C). FMS IgG ha anche marcato altre cellule, ma meno intensamente. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che FMS IgG

contiene anticorpi autoreattivi che legano gli antigeni espressi nel DRG.

Discussione

Qui dimostriamo che diverse caratteristiche chiave della FMS possono essere indotte nei topi da IgG da individui con FMS. Il trasferimento di ipersensibilità dai pazienti ai topi era riproducibile in tutti i soggetti FMS testati, suggerendo fortemente che i processi dipendenti dagli anticorpi in genere sono alla base della caratteristica dolorabilità e le ipersensibilità termiche sperimentate dai pazienti. L'effetto pronocicettivo delle IgG aggregate mostra che i campioni di pazienti diversi hanno attività additiva, poiché le IgG di ciascun donatore in queste preparazioni sono state diluite a livelli inferiori a quelli necessari per generare ipersensibilità nei topi. L'ipersensibilità comportamentale prodotta dall'FMS IgG era reversibile nei topi e si risolveva tipicamente dopo 2-3 settimane quando i livelli di IgG umane erano diminuiti (37). La riduzione della forza di presa e dell'attività locomotoria spontanea e la ridotta densità dell'innervazione epidermica osservata nei topi trattati con FMS IgG confermano che, oltre alle ipersensibilità dolorose, FMS IgG produce anche diversi sintomi e segni non evocati di FMS. Le preparazioni di siero deplete di IgG non avevano alcuna influenza sulla nocicezione meccanica o fredda, confermando che le IgG sono il principale componente sierico pronocettivo e patologico nei pazienti FMS. È importante sottolineare che le IgG FMS si legano agli SGC e ai neuroni nei DRG murini e umani, suggerendo fortemente che i pazienti FMS hanno anticorpi autoreattivi.

Le interazioni tra il sistema nervoso e quello immunitario, e in particolare i meccanismi autoimmuni, hanno attirato sempre più attenzione negli studi sulla fisiopatologia delle condizioni di dolore cronico (49, 50). Gli effetti pronocicettivi degli autoanticorpi sono stati implicati nella rara condizione post-traumatica sindrome del dolore regionale complesso (31, 51), in cui il trasferimento passivo di IgG richiede inoltre un trauma sperimentale per esercitare effetti pronocicettivi, a differenza delle osservazioni qui presentate per

FMS IgG. Nella condizione neurologica molto rara, spesso dolorosa, neuromiotonia, gli autoanticorpi contro la proteine simili 2 (CASPR2) sono comunemente rilevate (28). Il trasferimento passivo di IgG da questi pazienti produce ipersensibilità dolorose internalizzando i canali K+ voltaggio-dipendenti. I nostri risultati indicano che processi similmente non distruttivi producono ipersensibilità, sintomi motori e perdita di innervazione epidermica nella condizione comune FMS.

L'importanza della funzione alterata del sistema nervoso centrale e della plasticità nella FMS è illustrata da modelli alterati di attività cerebrale (19), attivazione della glia nel cervello (52), modulazione del dolore condizionato alterata (53) e ipersensibilità multisensoriale a un'ampia gamma di stimoli (1, 54, 55). Tuttavia, sta diventando sempre più chiaro che anche le alterazioni periferiche contribuiscono alla patologia sottostante, come esemplificato dall'identificazione della patologia delle piccole fibre nei pazienti FMS (33) e dai livelli alterati di citochine (24). Qui abbiamo scoperto che i nocicettori meccanosensibili nelle preparazioni dei nervi cutanei di topi trattati con FMS IgG mostravano una maggiore reattività agli stimoli meccanici e freddi, suggerendo fortemente che l'ipersensibilità dolorosa nella FMS è prodotta dalla sensibilizzazione di

nocicettori. Al contrario, l'applicazione diretta di IgG ai neuroni DRG isolati non ha avuto effetto su [Ca2+]i, coerente con un'azione indiretta che può coinvolgere l'attività di un ulteriore tipo di cellula periferica, come gli SGC.

In combinazione con le osservazioni elettrofisiologiche, la ritenzione di FMS IgG nel DRG, la mancanza di IgG nel cervello e nel midollo spinale e il legame in vivo di FMS IgG a SGC e neuroni suggeriscono fortemente che le azioni pronocicettive di FMS IgG sono state guidate da meccanismi periferici. Il legame di FMS IgG nel DRG umano e il legame in vitro di FMS IgG alla superficie di SGC e neuroni murini sottolinea ulteriormente che gli effetti nocicettivi indotti da FMS IgG possono derivare dal riconoscimento di epitopi nel DRG. Segni aumentati di attività SGC in vivo implicano che il legame di FMS IgG nel DRG ha effetti funzionali. È chiaro che SGC e neuroni sensoriali possono essere accoppiati elettricamente e che sia l'accresciuto accoppiamento che le citochine pronocicettive derivate da SGC possono influenzare l'eccitabilità neuronale che porta

all'ipersensibilità (56-58). Inoltre, l'accumulo di IgG FMS legate a SGC e neurone può stimolare cambiamenti molecolari nei macrofagi residenti nei DRG che contribuiscono all'ipersensibilità neuronale nonostante la mancanza di infiltrazione o proliferazione dei macrofagi. Inoltre, l'assenza di aumenti sistemici di citochine proinfiammatorie come TNF e IL-1β supporta ulteriormente la nostra ipotesi che FMS IgG agisca localmente nel DRG, senza indurre una risposta infiammatoria sistemica. Insieme, questi risultati indicano il DRG come un sito d'azione per FMS IgG e studi futuri studieranno i contributi delle IgG che agiscono su SGC e neuroni nel guidare le anomalie sensoriali legate al dolore e le ipersensibilità neuronali nei topi. Sebbene non abbiamo scoperto una caratteristica pattern di reattività nei sieri dei pazienti nel microarray proteico, abbiamo notato un numero sostanziale di autoreattività. I nostri risultati hanno anche indicato un certo arricchimento delle reattività contro proteine classificate in termini GO per i componenti cellulari e termini KEGG per le vie legate al metabolismo. Sebbene il potenziale arricchimento delle reattività possa essere incoraggiante, la loro rilevanza per la fisiopatologia della FMS non è attualmente chiara, poiché sono state rilevate principalmente in campioni singoli. Inoltre, la maggior parte delle proteine rilevanti per i termini potenzialmente arricchiti si trovano a livello intracellulare ed è quindi improbabile che vengano riconosciute dalle IgG circolanti.

Gli autoantigeni genuini possono anche essere sfuggiti al rilevamento, poiché è improbabile che i frammenti di proteine antigeniche linearizzati utilizzati nello schermo adottino la loro conformazione nativa sul chip (47). I peptidi e i frammenti proteici sono stati prodotti in E. coli e quindi mancano di modifiche post-traduzionali. La prevalenza delle reattività contro i peptidi umani nella nostra valutazione preliminare dei sieri dei pazienti è tuttavia coerente con le IgG autoreattive che sono responsabili dei nostri risultati. Curiosamente, i sieri di pazienti COVID-19 contengono un'ampia gamma di autoanticorpi funzionali, che sono stati proposti per influenzare il profilo sintomatico nei pazienti (59).

Nei pazienti FMS è stata osservata una patologia delle piccole fibre nervose e una riduzione dell'innervazione cutanea, che è associata a un carico di malattia più grave e può contribuire alla sensibilità periferica (33). Sorprendentemente, abbiamo osservato che il trasferimento di IgG FMS ai topi ha comportato una riduzione dell'IENFD nella pelle della zampa posteriore glabra. Negli esseri umani, non è ancora chiaro il motivo per cui si verifica una ridotta innervazione cutanea, ma i nostri risultati indicano che l'FMS IgG contribuisce a questa perdita di fibre. FMS IgG può guidare la denervazione dal DRG tramite SGC o il legame del corpo cellulare neuronale, ma può anche agire più distalmente attraverso altri meccanismi.

Studi futuri esamineranno i meccanismi cellulari e molecolari sottostanti responsabili della sensibilizzazione FMS IgG-mediata periferica

Resta da esplorare anche la possibilità che l'intenso input nocivo periferico prodotto da FMS IgG possa generare pattern alterati di attività nel sistema nervoso centrale (19). Allo stesso modo, è ancora da indagare se le IgG FMS guidano la sensibilità ad altre modalità sensoriali, come gli stimoli uditivi e olfattivi. L'identificazione di un ruolo fondamentale per le IgG autoreattive nella fisiopatologia della FMS potrebbe trasformare la ricerca futura e facilitare lo sviluppo di interventi terapeutici basati su meccanismi. I nostri risultati suggeriscono che le terapie che riducono il titolo totale di IgG, come la plasmaferesi o l'immunoadsorbimento (ad es. con colonne di proteina A), o che specificamente ridurre le IgG autoreattive (usando l'adsorbimento antigene-specifico) può essere efficace per la FMS (60). In alternativa, anche le terapie sintomatiche che interferiscono con il legame degli anticorpi autoreattivi o ne prevengono le conseguenze funzionali possono fornire approcci terapeutici efficaci.

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